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La impresion 3D fue adoptada como una técnica biotecnológica con un amplio uso en la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, contribuyendo favorablemente a una o más aplicaciones médicas en diferentes categorías:

Ayuda diagnostica y quirúrgica

 El uso de AM con el propósito de diagnóstico y como modelos quirúrgicos  fue probablemente la primera aplicación médica.  Los cirujanos trabajan en equipo con el apoyo de médicos y enfermeras durante una cirugía y los técnicos médicos previos a operaciones. Utilizan estructuras o modelos en 3D con el fin  de comprender los procedimientos quirúrgicos complejos así como para comunicarse con el demás personal de trabajo

Desarrollo de prótesis

A medida que la tecnología AM ha mejorado, los modelos lucen con  apariencia más anatómica y se han vuelto más precisos, siendo así posible la fabricación de dispositivos prostéticos con ajustes personalizados brindando mayor comodidad y rendimiento. 

Ingeniería de tejidos e impresión de órganos

 La fabricación de implantes del cuerpo para su remplazo empleando procesos de fabricación aditiva, en donde  se depositan células vivas, proteínas y otros materiales de ayuda para la regeneración de la estructura del tejido. Algunas técnicas de prototipado rápido han sido explotadas y adaptadas para la generación de andamios, tales como el modelado por deposición fundida, como la impresión en tres dimensiones (3DP), sinterizado selectivo por láser (SLS) y la estereolitografía (SLA).

Origen de Bioimpresión

En 1993, Langer y Vacanti definen por primera vez la ingeniería de tejidos como la siembra de  células a andamios formados por biomaeriales sólidos y rígidos para la fabricación de tejidos. El termino ingeniería de tejidos se introduce por el Dr. Fung  de la Universidad de California en San Diego en el año 1985. Esta área podría ser el origen de trasplantes de órganos  impresos en 3D, pero en el presente clínicamente no es aceptado el trasplante de órganos artificiales.

El cultivo celular es la colección y siembra dentro de los poros de un andamio preformado. Los andamios utilizados deben ser biocompatibles y degradables. Las células sembradas  deben permanecer vivas y poder penetrar o migrar dentro del andamio en lugar de quedarse sobre la superficie. El objetivo de la ingeniería de tejidos es crear el remplazo de órganos perdidos o enfermos y eventualmente resolver la crisis de  escases de donación de órganos.  

En 1999, el equipo de Anthony’s Atala’s del Instituto de Medicina regenerativa utilizaron  técnicas para la producción de andamios de una vejiga sintética humana, la que posteriormente fue cubierta con células tomadas de un paciente.

En el 2003 Tom Bolad, recibe la primera patente por una técnica de brioimpresion, la cual está basa en tecnología de inyección. Ese mismo año, Garbor Forgacs y su equipo en la universidad de Missouri crean esferas multicelulares por impresión 3D y su técnica es considerada el primer paso hacia los andamios de impresión de células libres. Al siguiente año prueban nuevamente la importancia de la fabricación aditiva biológica con el equipo Douglas Chisey´s en el Laboratorio de Investigación Naval aplicando tecnología láser para la impresión de bio-tintas “Bioinks” y células mamíferas dentro estructuras 3D.

El  siguiente gran paso para la industria ocurrió en el 2009 cuando Organovo e Invetech  crean la primer bioimpresora comercial y los investigadores dirigidos de Anthony Atala por Wake Forest University producen piel impresa considerada la más cercana al comienzo de remplazo de tejido funcional. Otros avances en bioimpresión han logrado construir modelos de  válvulas cardiacas y la formación de orejas. Finalmente en el 2014, Organovo aplico técnicas de bioimpresión para producir el primer modelo de hígado disponible. 

El uso de estas tecnologías avanzadas ha llevado a la compleja construcción multicelular en 3D. La habilidad de maquinar células y otros productos biológicos permiten una investigación sofisticada del comportamiento y enfermedades celulares.

Técnicas de la bioimpresión

La impresión 3D de componentes biológicos se separa en dos áreas: andamios de función  acelular que incorporan componentes biológicos, y la construcción con cargas de células para los procesos in vivo. Para ambas áreas la fabricación aditiva se ha estado adaptando  para producir biocompatibilidad en la construcción de implantes. La terminología que define estas áreas no se encuentra establecida por la literatura. Los términos bioploteo y bioimpresión se han usado intercambiablemente y estos no indican si las células se están imprimiendo o intervengan en cualquier fase del proceso. Estos métodos de impresión  no necesitan incluir células para ser categorizados como bioimpresión;  de cualquier forma las células pueden ser incluidas dentro del proceso.

Bioploteo se refiere al ploteo en 2D o 3D para cualquier componente o combinación de componentes biológicos dentro o sobre algún sustrato, tal como la superficie de una placa de Petri  o dentro de geles preformados utilizando robótica. La bioimpresión se refiere de forma más específica a la técnica de impresión y formulación de biomateriales,  que poseen componentes requeridos para generar estructuras sólidas. 

Ilustración 1 (A) Enfatiza la diferencia entre los métodos de bioploteo y bioimpresión (B) Esquema para el método de impresión de una bio-tinta

Impresión por Bio-inyección

El grupo de pioneros en esta técnica  convirtió una impresora de inyección 2D en una bioimpresora reemplazando la tinta de impresión con tinta biológica. Mientras la primer bioimpresión se enfoca en aplicaciones para ingeniería de tejidos, numerosos sistemas a base de inyección se encuentran desarrollando una amplia variedad de materiales biológicos e incrementando su resolución y velocidad. La eyección de bio-tintas es manejada por dos mecanismos estándar. La primera estrategia utiliza un pequeño actuador piezoeléctrico, aplicando un voltaje al actuador induce un rápido accionamiento, generando la presión necesaria para expulsar la tinta de la cámara. La segunda estrategia emplea un elemento calefactor, este elemento sobrecalienta la tinta creando burbujas de vapor que se expanden hasta empujar la tinta a través de la boquilla. El calentamiento rebasa los 300°C  pero está altamente localizado y solo persiste al orden de microsegundos. Algunas impresoras 3D con tecnología PolyJet emplean fotopolimerización. La fotopolimerización puede ser extruida de manera continua o depositada por el cabezal en discretas gotas formando líneas con una lámpara ultravioleta (UV).

Eyección de gotas por ondas acústicas

La eyección de gotas por ondas acústicas o Acoustic droplet ejection (ADE) produce un resultado similar a la impresión por inyección pero en una manera invertida sin tecnología de boquilla de eyección. Aquí se utiliza un pulso de ultrasonido para mover bajos volúmenes de fluidos (típicamente en nano-litros o pico-litros) sin contacto físico. Para generar gotas por eyección utilizan un transductor enviando ondas acústicas a la superficie para la formación de un punto focal acústico. La energía acústica de un pulso de ultrasonido induce la formación de un montículo de fluido hasta de un pico-litro por gota  proveniente del reservorio de la bio-tinta, hasta la superficie de la impresión. El goteo es eyectado  hacia arriba a la superficie de impresión (Ilustración 2). Con el uso de pequeños volúmenes la ventaja que se obtiene es la habilidad de deposición con un alto nivel de precisión.  El tamaño de goteo puede manipularse por variación de frecuencia de la energía acústica; frecuencias altas producen gotas pequeñas. Típicamente frecuencias entre 5-300Mhz son usadas para diámetros correspondientes entre 300-5 µm. En contraste con otras técnicas de impresión es que el goteo formado en el orificio cabezal es la perdida de precisión disminuyendo la transferencia de volumen. Las gotas por eyección acústica  no sufren de este problema en el mismo grado.

 

La tecnología ADE es en teoría un proceso suave, y esto puede ser aplicado para transferir productos biológicos sin daño o variabilidad. La capacidad de encapsular pocas células con micrométrica precisión, alta variabilidad, y control direccional usando ondas suaves para ser aplicadas en la ingeniería de tejidos, proyección de alto impacto y diagnóstico clínico. Este método muestra su utilidad en aplicación para RNA, ADN y análisis de proteínas. Una limitación de esta técnica es la necesidad de invertir sustratos por deposición, y no todos los sistemas celulares son vulnerables para su acumulación por este método. 

Ilustración 2 Esquema para tecnología de eyección de gotas por ondas acústicas. Un pulso de ultrasonido es utilizado para movimientos  bajos.

Estereolitografía (SLA)

La Estereolitografía o Stereolithography (SLA por sus siglas en inglés) utiliza un láser ultravioleta para la fotopolimerización en la superficie de un  baño de líquido polimérico. Este proceso se repite para generar líneas subsecuentes. Sus propiedades mecánicas son inicialmente débiles y pueden tener aplicaciones limitadas para bio-adhesivos, inyectables o andamios celulares. La resolución depende del tamaño del láser (75 a 250 µm)  y de la absorción o dispersión del haz del láser. 

 

Esta técnica está limitada en la elección de biomateriales para fotopolimerización. Algunas opciones son  derivados de acrilato de polietileno glicol (PEG), metacrilato de polietileno glicol (PEGMA), poli (alcohol vinílico) (PVA), acrilato de ácido hialurónico. Ilustración 3(A). 

 

 

 

 

 

Deposición Robótica (RD)

La deposición robótica (RD) es el fundamento de muchas técnicas de bioploteo y bioimpresión 3D descritas aquí. Esta técnica es  utilizada para dispensar volúmenes discretos de tintas o sustratos. Motores a pasos son programados con precisión para el posicionamiento del cabezal dispensador a lo largo de los ejes x, y, z. La posición es programada en series de líneas secuenciales. Ilustración 3(B). 

Nano-volúmenes de materiales dispensados pueden ser depositados en una superficie plana, dentro de líquido o gel. Este sistema puede ser configurado para dispensar volúmenes discretos para jeringas contenedoras de células en soluciones. El ploteo celular es preformado utilizando RD posicionando las células y los agregados celulares en las matrices biomimeticas.   

Ilustración 3 (A) esquema de proceso SLA. (B) esquema de sistema de RD básico

 

Comparado con la impresión por inyección, esta técnica es capaz de forzar una mayor expulsión formulas heterogéneas y tiene mayor tolerancia. La suma de estos beneficios  permite estar cerca de densidades celulares fisiológicas próximas, lo cual es una mejora para la eficiencia de la impresión de tejidos. La variabilidad celular puede ser baja después de la impresión por extracción comparada con el proceso de inyección. Esta técnica es adecuada en la fabricación de implantes basculares de capa acelular

Ensamble con escritura directa

El sistema de escritura directa permite prototipado 3D por dispensador de perlas de material a través de un orificio a microescala, directamente en un entorno que inicia el proceso de curado de la impresión Ilustración 4. La inicialización de curado puede ocurrir por temperatura, fotopolimerización, gradientes de humedad, o algún otro método de polimerización

Ilustración 4 De curación de una bio-tinta depositada dentro de un baño de solución polimérica usando escritura directa.

 

 

La escritura directa es compatible con bio-tintas que están formuladas por biopolímeros, hidrogeles, metales y cerámicos para aplicaciones de andamios celulares. La inclusión celular solo puede ser incorporada con componentes biológicos que a menudo son agregados de manera separada porque la toxicidad de los agentes de curación.

 

Las células solo pueden ser escritas en paralelo con colágeno. Esta técnica teóricamente permite la suspensión viable de células e hidrogeles en medio granular hasta que es lavada con agua dejando solo la estructura curada. La mayor ventaja de esta técnica es la habilidad de impresión helicoidal y trayectorias anudadas a lo largo de la dirección z  en las que no es requerida la construcción estándar línea por línea  de la fabricación aditiva. 

Modelado por deposición fundida (FDM)

El moldeado por deposición fundida (FMD por sus siglas en ingles) y otros sistemas a base de extrusión son los más utilizados como medio de impresión 3D. La técnica  (Ilustración 5(A)) a menudo emplea materiales termostáticos que son calentados a un estado casi fundido antes de la extrusión permitiendo la solidificación en la etapa de impresión. Este sistema es compatible con bio-tintas de altas viscosidades que son posibles mediante impresión de bio-inyección.

Ilustración 5  (A) Esquema de impresión por FDM. (B) Esquema de impresión celular 3D con extrusor directo a construcciones de bloques con agregados celulares

 

Los hidrogeles termoplásticos pueden ser impresos en rangos de 37 °C para permitir la inclusión de células. Los geles impresos pueden perder integridad y sufrir degradación por la geometría de impresión en condiciones del cultivo.

 

Impresion celular 3D

La impresión celular 3D es un proceso en donde unidades celulares solidas son impresas directamente con componentes aditivos, en contraste con estrategias que usan bio-tintas liquidas (ilustración 5 (B)). Esta técnica permite la bioimpresion de andamios libres de materiales exógenos. Los agregados celulares son impresos en bloques cilíndricos o esféricos con diámetros en rangos de los 260 a 500 µm por agregado.

Células de múltiples tipos pueden ser organizadas  en patrones de cocultivos precisos. Equipo de impresión en que se encuentra disponible  este proceso, tal como la bioimpresora NovoGen MMX  con el concepto de confianza en la rigidez del tejido.

 

Escritura directa de laser guiado (LGDW)

Es una técnica de bioimpresión por asistencia de laser capaz de depositar células con exactitud micrométrica en diversas superficies y matrices, incluyendo geles suaves. Esta técnica utiliza un haz de  láser débilmente enfocado para deposición de células basado en el principio de pinza óptica. El haz es capaz de controlar la deposición de células a través de fuerzas ópticas en rangos de pocos milímetros. El principal inconveniente de esta técnica es su aplicación en la construcción de figuras 3D con tamaño limitado en la matriz celular, y su impedimento de movimiento para apilarse en el eje z.

 

Impresión en 3D con polvos 3DP

La efectividad de impresión 3DP transforma la tecnología de inyección a un verdadero enfoque de la fabricación aditiva. La tecnología 3DP fusiona líneas de biomateriales en polvo como son almidón, dextrano, gelatinas o fosfato de calcio.  Dependiendo de la sintonización las partículas se funden utilizando soluciones de aglutinante como son agua o ácido fosfórico que son depositadas dentro de la cama de polvos a través de un cabezal para impresión (ilustración 6) 

Esta técnica promueve mejores opciones para la ingeniería de tejidos y la administración de fármacos porque incorpora componentes bio-activos que no somete a efectos de deterioro mediante laser o por solventes tóxicos. La limitante del sistema de polvos es la dificultad de remover el polvo no unido entre los espacios negativos. Los Biomateriales en polvo tales como el fosfato de tetra-calcio y el sulfato de calcio que están ligados con soluciones tales como ácidos cítricos que generan construcciones parecidas al hueso. Andamios cerámicos porosos como canales interconectados se encuentran fabricados vía 3DP directamente por polvos de hidroxiapatita para remplazo de hueso.